Хотелось бы спросить о методе ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Каков механизм его работы и как он используется для определения трехмерной структуры белка?
7 лайков
В ленинджере пробовали искать?
Если конкретено то про NMR было написано в 4 чаптере, про разные методы для определения структуры белка BOX 4-5
7 лайков
Да конечно, я там уже читала, и я столкнулась с трудностями в его понимании из-за множества терминов(из физики) и недостатка наглядных объяснений. Может быть, есть более простые и понятные источники или методы обучения, которые помогли бы мне лучше освоить эту тему?
5 лайков
А насколько глубоко вы хотите понять метод?
Одно дело просто понимать какого рода информацию он дает и при каких условиях.
Другое дело понимать что именно на атомарном уровне замеряет ЯМР. Без хоть какого-то понимания квантов этого не достичь. У нас химики периодически задают вопросы по ямр (поищите в поиске), посмотрите какие жаркие и долгие дискуссии это открывает)
4 лайка
Я хотела бы лишь поверхностно понять, как мы используем его для определения структуры белка с точки зрения биологии
Именно из-за этих трудности я здесь обращаюсь за просьбой о помощи
4 лайка
Добрый вечер!
Могу посоветовать Cambridge International AS and A level Chemistry Coursebook (2nd edition), p. 439, где есть объяснение low-resolution and high-resolution NMR, H-NMR и C-NMR. Есть также Chemguide, Save my exams и другие ресурсы. Это - для освоения его принципа работы
Удачи в подготовке!
5 лайков
@eudaimon попробуй объяснить максимально понятно для человека не знакомого с квантовой механикой что мы можем узнать о белках с помощью ЯМР и как именно ЯМР позволяет нам это узнать.
3 лайка
@kyrmyzy, чтобы максимально упростить объяснение работы ЯМР (ядерного магнитного резонанса) в контексте определения структуры белка, представьте, что каждый атом в молекуле белка — это маленький магнит. Когда мы помещаем белок в мощное магнитное поле ЯМР-спектрометра, эти “магниты” ориентируются относительно этого поля. При этом, если их “поколебать” с помощью радиоволн правильной частоты, они могут переориентироваться и испускать сигналы, которые можно измерить.
Как мы используем ЯМР для определения структуры белка:
-
Локализация атомов: С помощью ЯМР мы можем определить, где в пространстве находятся атомы в молекуле белка. Это возможно, потому что каждый тип атома (например, водород, кислород, углерод) и их химическое окружение влияют на частоту радиоволн, на которые они “откликаются”. По изменениям в этих “откликах”, можно вычислить, насколько близко атомы находятся друг к другу.
-
Взаимодействие атомов: Помимо расположения атомов, ЯМР позволяет определить их взаимодействие друг с другом. Это важно, потому что взаимодействия между атомами определяют структуру белка. Например, можно измерить, насколько сильно атомы “взаимодействуют” на определенных расстояниях, что дает представление о трехмерной структуре белка.
-
Динамика: Белки — не статичные структуры; они меняют свою форму и структуру в зависимости от окружающих условий. ЯМР позволяет наблюдать за этими изменениями в реальном времени, давая представление о том, как белок “работает” в клетке.
Ключевые выводы:
- ЯМР ищет “магнитный отклик” атомов белка в магнитном поле, что позволяет определить их расположение и взаимодействие друг с другом.
- Эта информация используется для построения трехмерной модели структуры белка, помогая понять его функцию на молекулярном уровне.
- Также ЯМР подсказывает о динамике структур, что критически важно для понимания многих биологических процессов.
Надеюсь, это объяснение оказалось понятным и полезным для вас, @kyrmyzy. Если есть ещё вопросы или что-то непонятно, не стесняйтесь спрашивать дополнительно.
5 лайков
@eudaimon что нужно сделать с раствором белка, чтобы подготовить его к снятию ЯМР спектра? Что мы можем узнать о белке помимо его структуры с помощью ЯМР? Какую информацию мы можем получить из ЯМР, которую не можем получить из X-Ray Crystallography или Cryo-EM?
3 лайка
@Anton, замечательный вопрос! Подготовка раствора белка для ЯМР-спектроскопии включает в себя несколько ключевых шагов, чтобы обеспечить получение четких и информативных спектров. Помимо структурной информации, ЯМР также может предоставить уникальные сведения о белке, которые дополняют или превосходят те, что можно получить с помощью X-Ray Crystallography (рентгеновской кристаллографии) или Cryo-EM (криоэлектронной микроскопии).
Подготовка раствора белка:
-
Концентрация и очистка: Белок должен быть высокоочищенным и достаточно концентрированным (обычно от 0.2 до 1 мМ). Это минимизирует шум и улучшает качество сигнала.
-
Изотопная меченость: Для детализации взаимодействий и упрощения интерпретации спектров, белки часто метят изотопами ^{15}N и ^{13}C, что позволяет отслеживать отдельные атомы.
-
pH и соль: Раствор белка должен иметь подходящий pH и ионную силу, чтобы поддерживать его стабильность и обеспечить репрезентативность функциональной структуры.
-
Буферный раствор: Выбор подходящего буфера важен для поддержания стабильности белка во время измерений.
-
Температура: Оптимальная температура для эксперимента выбирается так, чтобы белок был в растворимой и активной форме.
Информация, которую предоставляет ЯМР:
-
Динамика молекул: ЯМР может детектировать молекулярную динамику и гибкость в различных временных масштабах, что дает представление о том, как белок меняет свою конформацию и как это влияет на его функцию.
-
Взаимодействие между молекулами: Через анализ спектров ЯМР можно изучить взаимодействие белка с другими молекулами (например, с лигандами, ДНК, РНК или другими белками), что ключево для понимания механизмов взаимодействия.
-
Химическое окружение отдельных атомов: ЯМР предоставляет детальную информацию об электронном окружении конкретных атомов в структуре белка.
Преимущества ЯМР перед другими методами:
- Работа с растворимыми веществами: В отличие от рентгеновской кристаллографии, не требуется кристаллизация белка, что особенно важно для изучения гибких или плохо кристаллизуемых белков.
- Нативные условия: Эксперименты ЯМР проводятся в условиях, близких к нативным, позволяя изучать молекулы в более физиологичных условиях.
- Молекулярная динамика: ЯМР уникально подходит для изучения динамики белков, их конформационных изменений и взаимодействий в реальном времени.
Эти различия делают ЯМР мощным инструментом не только для структурного, но и для функционального анализа белков, дополняя и расширяя данные, получаемые с помощью X-Ray Crystallography и Cryo-EM.
4 лайка
@eudaimon ты перечислил основные преимущества ЯМР перед рентгеновской кристаллографией, но что насчет его недостатков?
3 лайка
@beksiiik, хороший вопрос. ЯМР (ядерный магнитный резонанс) действительно имеет ряд недостатков по сравнению с рентгеновской кристаллографией и другими методами структурной биологии. Рассмотрим основные из них:
1. Чувствительность и размер белка:
ЯМР менее чувствителен по сравнению с рентгеновской кристаллографией. На практике это означает, что ЯМР идеально подходит для изучения белков меньшего размера (до 25-30 кДа). Для более крупных молекул (более 100 кДа) снятие четких спектров становится сложной задачей, хотя современные технологии и методы могут немного расширить эту границу.
2. Концентрация образца:
Для успешного снятия ЯМР-спектра требуются относительно высокие концентрации образца, что может быть сложно достичь для некоторых белков, особенно для тех, которые сложны в экспрессии или склонны к агрегации.
3. Время и ресурсы:
Анализ и интерпретация ЯМР-данных требует значительного времени и ресурсов. Методика включает в себя продолжительный сбор данных, сложные вычисления и анализ спектров. Высокоскоростные компьютеры и специальное программное обеспечение часто необходимы для обработки и интерпретации данных.
4. Требования к оборудованию:
ЯМР-спектроскопия требует доступа к дорогостоящему оборудованию, включая высокопольные магниты и специализированные приборы. Это может ограничивать доступность метода для многих исследовательских групп.
5. Трудности с кристаллизацией:
Хотя это и не недостаток ЯМР как такового, но отметим, что некоторые белки трудно или невозможно кристаллизовать для рентгеновской кристаллографии, что могло бы сделать ЯМР предпочтительным методом. Однако сложности с получением крупных, высококачественных кристаллов никак не влияют на возможности ЯМР, что ставит его в уникальное положение для изучения таких систем.
Подведя итог, можно сказать, что, несмотря на свои преимущества, ЯМР-спектроскопия имеет свои ограничения. Выбор метода исследования зависит от конкретных задач и условий эксперимента, причем часто ЯМР и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга, предоставляя комплексное понимание структуры и функции белков.
4 лайка
По сути, те же минусы, что и у рентгеновской кристаллографии.
@eudaimon Но у меня другой вопрос. В следствие чего возникают диффракционные пятна на детекторе в X-ray crystallography? Насколько я понимаю, зная расположение этих пятен, мы можем найти углы и интенсивность отражения лучей, и уже имея эту информацию мы находим карту электронной плотности, по которой мы находим примерную структуру вещества
1 лайк
@beksiiik, действительно, вы верно понимаете основной принцип работы рентгеновской кристаллографии. Давайте разберемся, в следствие чего возникают диффракционные пятна на детекторе и как это связано с определением структуры вещества.
Возникновение диффракционных пятен:
-
Коэрентное рассеяние: Когда рентгеновские лучи попадают на кристалл, они рассеиваются атомами (точнее, их электронными облаками) в кристаллической решетке. Это рассеяние является коэрентным, что значит, волны от разных атомов могут интерферировать друг с другом.
-
Конструктивная и деструктивная интерференция: В некоторых направлениях волны усиливают друг друга (конструктивная интерференция), вызывая яркие диффракционные пятна на детекторе, в других – волны гасят друг друга (деструктивная интерференция), и пятен не возникает.
-
Закон Брэгга: Углы, под которыми наблюдаются диффракционные максимумы (пятна), удовлетворяют условию Брэгга: n\lambda = 2d\sin(\theta), где n - порядок дифракции, \lambda - длина волны рентгеновских лучей, d - расстояние между рассеивающими плоскостями в кристалле, \theta - угол между направлением падающего луча и рассеивающей плоскостью.
Определение структуры вещества:
-
Из положения дифракционных пятен (которое зависит от углов \theta) и измеренной интенсивности этих пятен можно вывести информацию о расстояниях между рассеивающими плоскостями в кристалле (d-значения).
-
С помощью преобразования Фурье интенсивностей этой двумерной дифракционной картины во взаимном пространстве можно получить трехмерную карту электронной плотности вещества в кристалле.
-
Интерпретируя карту электронной плотности, ученые определяют положения атомов в кристаллической структуре и, тем самым, определяют примерную трехмерную структуру вещества.
Таким образом, дифракционные пятна на детекторе – это ключ к раскрытию структуры кристаллизованных веществ, и на основе этой информации можно восстановить детальное расположение атомов в кристаллической решетке.
3 лайка
@eudaimon можешь объяснить one-dimensional 1H NMR spectrum, что за точки и переменные там такие, и как мы получаем структуру макромолекулы из two-dimensional NMR data
2 лайка
@beksiiik, разберемся сначала с одномерным ^1H ЯМР-спектром, а затем перейдем к двумерным ЯМР-данным и их использованию для получения структуры макромолекул.
Одномерный ^1H ЯМР-спектр
В одномерном ^1H ЯМР-спектре наблюдаются пики, соответствующие различным протонам (атомам водорода) в молекуле. Рассмотрим ключевые характеристики этих пиков:
-
Химический сдвиг: Разное электронное окружение протонов в молекуле приводит к тому, что для возбуждения резонанса у них нужны немного разные частоты. Это приводит к появлению пиков в различных положениях в спектре (измеряется в ppm — частей на миллион). Химический сдвиг дает информацию о типе химического окружения протона.
-
Интенсивность пика: Отражает количество протонов, дающих резонанс в данном положении спектра. Это позволяет определить, сколько протонов имеет похожее электронное окружение.
-
Константа спин-спинового взаимодействия (J-связь): Расщепление пика на несколько мелких пиков (мультиплетность) происходит из-за взаимодействия спинов протонов. Эта информация помогает определять близость протонов друг к другу в пространственной структуре молекулы.
Используя эти данные, можно определить химическую структуру молекулы, узнать о типах химических связей и угадать некоторые аспекты пространственного расположения атомов.
Двумерный ЯМР (2D NMR)
Двумерные техники, такие как COSY, NOESY, HSQC, и HMBC, предоставляют гораздо более детальное представление о структуре молекул, особенно полезное для макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты.
-
COSY (Correlated Spectroscopy): Позволяет идентифицировать все протон-протонные связи в молекуле, выявляя прямое и через атом соседство протонов.
-
NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Используется для определения пространственного расположения атомов, выявляя корреляции между протонами, которые находятся близко друг к другу в трехмерном пространстве, но не обязательно связаны через химические связи.
-
HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Помогает коррелировать протоны с соседними атомами углерода или азота в молекулах, где присутствуют разные типы атомов.
-
HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation): Определяет связь между протонами и атомами углерода/азота через несколько химических связей.
Использование этих методов в комбинации позволяет не только определить первичную структуру макромолекулы, но и дает информацию о её трехмерной конформации. Таким образом, 2D ЯМР-спектроскопия открывает возможность детального изучения структуры и динамики макромолекул в растворе, что особенно ценно для понимания биологических функций на молекулярном уровне.
3 лайка
@eudaimon Я не понял значение химического сдвига. По описанию похоже, будто бы это значение спектра с частотой, которая необходима для возбуждения резонанса, но почему он тогда измеряется в частицах на миллион?
3 лайка
@beksiiik, попробуем разобраться с понятием химического сдвига в ЯМР-спектроскопии более подробно.
Химический сдвиг действительно связан с частотой, на которой конкретные атомы водорода (или других ядер) в молекуле поглощают энергию для перехода в возбужденное состояние, т.е., в состояние с высшим уровнем энергии спина. Однако ключевым моментом является то, как именно мы измеряем и выражаем этот химический сдвиг.
Поскольку абсолютные частоты резонанса могут слегка варьировать в зависимости от мощности магнита в ЯМР-спектрометре, использованного для эксперимента, абсолютные частоты резонанса не дают удобной и универсальной метрики для сравнения данных, полученных на разных устройствах. Вместо этого используется относительная шкала, выражаемая в частях на миллион (ppm), которая позволяет универсально сравнивать данные ЯМР-спектров, независимо от силы магнитного поля спектрометра.
$$ \Delta \sigma = \frac{\nu_{sample} - \nu_{standard}}{\nu_{0}} \times 10^6 $$
где:
- \Delta \sigma - химический сдвиг в ppm
- \nu_{sample} - частота резонанса изучаемого образца
- \nu_{standard} - частота резонанса эталонного соединения (например, тетраметилсилана, TMS)
- \nu_{0} - рабочая частота спектрометра
Измерение в ppm эффективно уравнивает различия между спектрометрами, позволяя исследователям сравнивать химические сдвиги протонов в одинаковых условиях. Таким образом, химический сдвиг отражает, насколько сильно локальное электронное окружение “экранирует” ядро протона от внешнего магнитного поля, вызывая смещение его частоты резонанса относительно эталонного стандарта.
Надеюсь, это пояснение помогает лучше понять, почему химический сдвиг измеряется именно в ppm и какую роль он играет в интерпретации ЯМР-спектров.
4 лайка
как я понял, мы испускаем электромагнитные волны, и грубо говоря, если ядро реагирует очень сильно, т.е. частота резонанса меняется очень “легко” (высокое значение химического сдвига), то там скорее всего мало электронов/они находятся довольно далеко и таким образом не сильно препятствуют внешним электромагнитным волнам
под реагированием я имею ввиду изменение положения ядра
2 лайка
@beksiiik, вы верно пришли к пониманию, что реакция ядра на электромагнитные волны связана с его окружением, однако давайте уточним несколько моментов для полноты картины.
В ЯМР-спектроскопии ядра не меняют своего положения в пространстве под действием электромагнитных волн. Вместо этого, под “реакцией” ядра на внешнее магнитное поле и приложенные радиочастотные (РЧ) пульсы электромагнитного поля, подразумевается изменение состояния его спина — от нижнего энергетического уровня к верхнему.
Ключевой момент здесь влияние локального электронного окружения на ядро. Эти электроны защищают (или “экранируют”) ядро от внешнего магнитного поля. Ядра, окруженные большим количеством электронов, будут более эффективно экранированы, что приводит к меньшему химическому сдвигу, поскольку для возбуждения их спина требуется меньшая энергия (или частота РЧ-пульса). С другой стороны, если ядро экранировано слабо (например, если вокруг него мало электронов, или они расположены дальше), оно будет более открыто для влияния внешнего магнитного поля. В этом случае, для перевода такого ядра в возбужденное состояние потребуется радиочастотный пульс с другой частотой, что проявляется как более высокий химический сдвиг в ЯМР-спектре.
Таким образом, вы правы — изменение частоты резонанса (и, соответственно, значение химического сдвига) связано с “легкостью”, с которой ядро “реагирует” на пульс радиочастотного поля. Это во многом определяется количеством и расположением электронов вокруг ядра, что и отражает его электронное окружение в молекуле.
3 лайка